Texto escrito por Dani Martínez
Volvemos a la carga con la microbiota y cómo se estudia. En la última entrada os estuve hablando sobre algunos aspectos básicos de qué se hacía para “cazar” a estos escurridizos habitantes mediante el uso de un gen marcador. También os comenté que, a veces, hace falta amplificar estos genes mediante el uso de la técnica PCR. Por lo tanto, si hacemos un poco de retrospectiva, tenemos una muestra con muchos genes del 16S (la parte del ribosoma que nos importa) y queremos saber exactamente cómo son. ¿Cómo lo hacemos? Bien, aquí llegamos a otra de las tecnologías que ha supuesto un antes y un después en el ámbito biológico, y que ahora está teniendo una repercusión enorme en el terreno de la salud: la secuenciación.
Si habéis estado leyendo las anteriores entradas, esta palabra os sonará algo porque la he repetido un par de veces. Pero, ¿qué es la secuenciación? ¿qué se hace con ello? De forma somera, la secuenciación es un tipo de tecnología que nos permite obtener una lectura de los nucleótidos de una secuencia para saber cómo es. Es decir, nos permite “leer” el DNA como si de una tira se tratara, permitiéndonos saber qué letras lo conforman. Pensad por un momento la potencia que nos da este conocimiento, de pronto podemos saber qué hay escrito en los genomas de los organismos vivos. Esto nos permite estudiar con un gran nivel de profundidad desde la historia evolutiva hasta permitir la capacidad de aplicar este conocimiento a campos como la agricultura o la medicina. Gracias a esta tecnología, hoy tenemos un conocimiento mucho mayor de los genomas de los seres vivos, y claro está, muchas preguntas interesantes a las que responder. Pero eso ya se verá en otras entradas.
En esta entrada me gustaría enseñaros la tecnología que impulsó la secuenciación. Para ello os hablaré un poco de algunos aspectos de la biología molecular del ADN, ya que son necesarios para entender cómo funciona. En un principio iba a hablar también de las tecnologías que se utilizan actualmente, pero como al final ha quedado una entrada algo densa por estos conceptos moleculares, dejaré para más adelante la explicación. Porque aunque la idea es leer esas letras, la forma de hacerlo puede ser muy diferente entre las distintas soluciones. De hecho, es un campo de estudio muy activo hoy en día, donde se están consiguiendo avances enormes cada poco tiempo. Pero bueno, empecemos con lo que nos toca.
El método de Sanger
Que conste desde un inicio que este método ya no se usa, pero dada la importancia que tuvo y lo fácil que es de entender voy a dedicarle unas palabras. Además, es un ejemplo claro de la ciencia que se hacía antes y la que se hace ahora, ya que Sanger tardó varios años en diseñar este método. Años en los cuales no publicó nada pero nunca le faltó un plato de comida en su mesa. En la actualidad, y sobre todo en ciencias biológicas, intentad ver si hay alguien que no haya publicado una o más cosas cada año. Eran tiempos diferentes y un mercado no tan voraz como tenemos hoy en día.
Pero bueno, empecemos con el tema. El método de Sanger se basa en la utilización de didesoxirribonucleótidos (o ddNTP). Este palabro tan raro viene de quitarle un grupo hidroxilo (un oxígeno con un hidrógeno) al desoxinucleótido. Este segundo palabro debería ser más reconocible, puesto que ¡es nuestro propio ADN! De hecho, ADN significa ácido desoxirribonucleico. Para aclarar un poco más el tema, fijémonos en la siguiente imagen.
En la imagen vemos dos representaciones cíclicas de la ribosa, el azúcar que acompaña a cada una de las bases. Si os fijáis, hay una flecha que señala el cambio entre la ribosa normal (izquierda) y la desoxirribosa (derecha), donde le falta un hidrógeno al grupo hidroxilo que está situado en lo que se llama el segundo carbono, o C2. La posición es importante, pues como veis en la siguiente imagen, ahora falta un hidrógeno en el C3.
¿Por qué es importante esto? Una vez ya hemos aprendido lo que es un didesoxirribonucleótido, ahora sabemos que le falta un hidrógeno en el tercer carbono. Y aquí viene otro detalle importante de la biología molecular, la dirección importa. Cuando se está generando una nueva hebra de ADN, ésta se genera desde el extremo que se llama 5’ hacia el extremo 3’, tal y como veis en la siguiente imagen. El 5’ sería ese carbono que sobresale del pentágono que vemos, mientras que el 3’ hace referencia al tercer carbono que ya hemos comentado. Es decir, que cuando se añade un nucleótido más a la cadena que se está gestando, éste se añade al extremo 3’ libre mediante el radical que está unido al 5’ del nuevo nucleótido. Radical que es un fosfato, y que genera una especie de estructura que protege al ADN.
Para los profanos en el tema puede hacerse un poco duro lo que acabo de contar, pero ya casi lo tenemos. Por lo menos, ya tenemos todos los ingredientes para que la reacción principal de este método pueda funcionar.
Como he comentado, en la generación de una nueva hebra de ADN, los nuevos nucleótidos se van situando conectando su fosfato en 5’ con el radical hidroxilo del carbono 3 de la hebra en formación. Entonces, puede que os preguntéis, ¿qué pasaría si el nucleótido de la hebra fuera un didesoxirribonucleótido de estos? ¡Pues que no se puede pegar nada más a su terminación! Y aquí radica el mayor secreto de este método. Así que ahora vamos a pasar a relatarlo con más detalle.
Recordad que el objetivo es saber la disposición de esas letras (A, C, T, G) dentro de una secuencia de ADN que nos interese. Para ello, lo primero que hacemos es desnaturalizarla, es decir, hacer que pase de ser una doble hebra a una cadena sencilla, para que pueda ser copiada más adelante. Esto lo hacemos en cuatro tubos por separado, donde a esta secuencia objetivo le añadimos una solución con los nucleótidos normales, dispuestos para ser añadidos a la cadena. Además, a cada uno de estos tubos le añadimos un didesoxirribonucleótido diferente. Es decir, a un tubo le añadiremos ddATP, a otro ddCTP, etc, hasta tener en cada tubo la secuencia, los cuatro nucleótidos normales, y un ddNTP diferente. Además, añadimos otra cosa a todos los tubos, algo que denominamos cebador o “primer”. Esto es una secuencia de ADN muy corta que se pega a alguna parte de nuestra secuencia objetivo, y gracias a la cual se puede empezar a copiar. Es decir, para que la ADN polimerasa (la enzima que copia el ADN) empiece a copiar, necesita un pequeño empujón, algo que la incite a comenzar, y eso es este pequeño fragmento de ADN. Todo se ve más claro en la imagen de más abajo.
Con todos los ingredientes metidos, comienza la reacción, ¿y qué pasa entonces? En cada uno de los tubos se empieza a copiar la secuencia objetivo pero algunos fragmentos paran antes de tiempo porque meten un ddNTP en vez de un dNTP normal y corriente, lo que hace que la reacción pare y se genere una secuencia más corta de lo deseado. O mejor dicho de lo esperado, porque lo deseado es que se genere este tipo de secuencias. En cada uno de los tubos estos fragmentos serán diferentes de los demás porque el ddNTP que les hemos metido es distinto, por lo tanto la reacción parará en diferentes posiciones.
Por último, tenemos todos estos fragmentos diferentes, ¿qué podemos hacer con ellos? Bueno, al ser diferentes, pesan diferente, por lo que podemos apoyarnos en eso. Para separarlos acudimos a otra técnica clásica de laboratorio: el gel de agarosa. Básicamente consiste en construir un gel con una determinada concentración, parecido a una gelatina de esas que te puedes comer. Entonces se le introduce la solución con los fragmentos que tenemos en uno de los extremos, y aplicamos una pequeña corriente eléctrica para separar esos fragmentos. La molécula de ADN está parcialmente cargada y tiene más afinidad a uno de los polos, y esta carga es directamente proporcional a la masa, o lo que es lo mismo (o casi), es proporcional al tamaño. Por lo tanto, gracias a la utilización del gel podemos separar estos fragmentos por tamaño, como en la parte de debajo de la anterior figura, o como en la que se muestra ahora.
Lo que nos queda al final son unas bandas definidas en cada una de las columnas, eso con suerte. Entonces lo que queda es ir formando el puzle, desde la banda que está en un extremo hasta la que está en el extremo contrario. La primera banda marca el primer nucleótido que conocemos, por ejemplo la adenina. ¿Por qué adenina? Porque sabemos que, dado el ddNTP que introdujimos en ese tubo, esa secuencia que ha producido esa banda termina en adenina. La siguiente banda puede estar en la misma columna o cambiar, por ejemplo, a una citosina. De esta forma vamos uniendo la información hasta que tenemos una secuencia. ¡Pero ojo! Esa es la secuencia complementaria a la original, por lo que tenemos que hacer la complementaria de la obtenida para conseguir la original. Es decir, donde teníamos una adenina, ahora pondremos una timina, donde tenemos una citosina ponemos una guanina, y viceversa para ambos casos.
¡Y hemos acabado! Este método, tedioso y lleno de complicaciones, supuso un antes y un después en la biología. Y gracias al concepto detrás de la técnica hoy en día somos capaces de hacer cosas que hace 10 años ni se creían posibles, como secuenciar todo el exoma humano (la parte que codifica proteínas) en cuestión de horas y por muy poco dinero. El presente ya es muy prometedor, y de eso os hablaré en la próxima entrega.
Daniel Martínez Martínez (@dan_martimarti) es licenciado en Ciencias Biológicas por la Universidad de Valencia, donde también realizó el máster Biología molecular, celular y genética. Realizó su doctorado a caballo entre el FISABIO (Fundación para el fomento de la investigación Sanitaria y Biomédica) y el IFIC (Instituto de Física Corpuscular). Su labor investigadora está centrada en el estudio de la relación entre la composición funcional y de diversidad de la microbiota humana, y el estado de salud-enfermedad de los individuos. Durante los últimos años ha mantenido una actividad de divulgación científica escrita, además de participar en la organización de eventos como Expociencia. Actualmente trabaja en el Imperial College de Londres.